barcode，也叫index，在二代测序里面是用于区分不同样品的。为了避免概念扩大，在此处仅指的在二代测序（NGS）里面的barcode。

barcode是做什么的

当今二代测序仪器中应用最为广泛的当属illumina公司的测序仪，以Hiseq-2000测序仪为例，其有2个流动槽（flowcell），每个flowcell有8条lane（通道），而单就其一条lane的测序数据量就可达44G。

然而对于目前的外显子组测序来说，测序区域大约64M，测序深度200X，总数据量也才13G，Hiseq-2000的一个lane就足以测定3个外显子组样品。以转录组来说，一个样品测序量不会超过4G，一个lane可以同时测定10个转录组样品。

大体而言，外显子组测序、转录组测序、miRNA测序、lncRNA测序、ChIP测序等组数据，每个样品所需的数据量通常都比较少。

barcode是样品标签

由于测序仪器的测序能力远大于测试样本序列量，为避免仪器浪费，因此一个lane同时测定多个样品成为很自然的思路。然而为了区分多种样品的序列，就必须要给不同样品加上特定的“标签”，从而可以在后续数据分析时将不同样品数据分开，而这个“标签”就是barcode。

简言之，barcode就是测序中混合样品的”身份证“，用于区分不同样品。

如何选择好的barcode

barcode的选择有两个原则：碱基平衡和激光平衡。

碱基平衡

碱基平衡是指的需要兼顾barcode序列的平衡度与复杂度，平衡度是指的碱基的比例是均衡的（1:1是最均衡的），而复杂度是指的碱基的种类是多样的（四种碱基同时存在是最多样的）。

所以最好的barcode序列应该是同时有A、T、G、C四种碱基，且各碱基所占比例近似均为25%。

此处所说的碱基平衡是指的多个barcode之间的平衡，并非一个barcode内部的碱基平衡。举例来说，有12个转录组样品需要测定，那么就需要12个barcode（假定每个barcode长度为6位），根据碱基平衡原则，第一位barcode碱基应该尽量同时存在A、T、G、C四种碱基，且各碱基所占比例近似均为25%，也就是这12个barcode序列最佳情况应该是以A、T、G、C开头各3个。剩余5个碱基位的barcode以此类推。

激光平衡

在illumina测序仪中，A和C两种碱基共用一种激光，由波长660nm的红激光激发；G和T共用一种激光，由波长532 nm的绿激光激发。因此假使不能满足碱基平衡的情况下，可以退而求其次，尽量满足激光平衡。简单来说，激光平衡就是尽量在使用的一组barcode中满足每个碱基位都是A+C=G+T。

既不满足碱基平衡，又不满足激光平衡的barcode将会有很大的数据分离隐患，或者无法分离开样品，或者无法识别某些测序片段。

Illumina推荐的12个barcode序列详列如下。

ATCACG

CGATGT

TTAGGC

TGACCA

ACAGTG

GCCAAT

CAGATC

ACTTGA

GATCAG

TAGCTT

GGCTAC

CTTGTA

建库测序时barcode是如何发挥作用的

这里以illumina测序仪为例。如图所示，在最下面的构建完好的可上级测序的序列中，insert是样品片段，barcode（图中的“i"）位于下游接头中。"a”与“e"是接头序列，用于结合到测序仪的flowcell上的P5和P7序列。